HLA란?

사람의 백혈구에서 발견된 항원이라는 의미의 Human Leukocyte Antigen (HLA)은 사람의 6번째 염색체에 위치하며 크기가 약 4X106 염기쌍(base pairs) 이상의 DNA로 200개 이상의 유전자를 가지고 있으며 class I (HLA-A, B, C), class II(HLA-DR, DQ, DP), class III 유전자로 이루어져 있고 조직이나 장기이식시 이식된 장기의 운명을 결정짓는 중요한(Major) 유전자들 (Complex)로 유전적으로

동일한 또는 비슷한 장기가 이식될 경우 이식된 장기가 잘 생존하고 (histocompatible) 그렇지 않은 경우 거부 (incompatible)하는 유전자들과 이들 유전자들이 생성하는 물질 (antigen)을 총칭한다.

HLA 검사법 HLA 검사방법의 종류는 크게 혈청학적 검사법과 DNA 검사법으로 나눌 수 있다. 혈청학적 방법은 환자의 림프구에 존재하는 HLA 항원을 검사하는 것이고 DNA 검사법은 환자의 DNA를 추출해 유전자수준에서의 HLA 형별을 판정하는 것이다. 현재 HLA class I (A,B,C) 검사에는 혈청학적 방법이 사용되고 있으나 점차 DNA 검사법들을 널리 사용되고 있으며 HLA class II 검사는 현재 혈청학적 방법보다는 DNA 검사법이 널리 사용되고 있다. 가톨릭조혈모세포은행에서는 혈청학적인 방법을 1980년대부터 개발 착수 하여 1995년 (주) 종근당과 협동으로 상품화 하여 사용하였으나 1996년 이후 부터는 자체 제작한 DNA 검사법을 개발하여 사용하고 있다.

- 혈청학적인 검사기법 1964년 미국 Terasaki 등이 개발한 보체의존성 미세림프구독성검사 (complement-mediated microlymphocytotoxicity)법을 약간 변형하여 현재 사용하고 있으며 주로 상품화된 plate를 사용하고 있다. 이 plate의 각 well(60-72개)에는 양성대조혈청, 음성대조혈청 및 각 HLA 항원에 대한 항체가 분주되어 있고 HLA plate의 각 well에 검사하고자 하는 림프구부유액을 분주하여 반응시키면 특정한 HLA 항혈청에 반응하는 HLA 항원이 있는 경우 항원-항체반응이 일어나고 여기에 가토의 보체를 가하면 보체결합반응에 의해 세포가 융해된다. 융해된 세포는 Eosin Y 등의 염색약에 염색되어 역위위상차현미경 (inverted phase contrast microscope) 하에서 크고 붉게 보인다. 판독 결과 양성반응을 보인 well의 HLA 항체 특이성에 따라 HLA 항원의 종류를 결정하게 된다.

- DNA 검사방법 HLA DNA 검사법은 중합효소연쇄반응 (PCR)을 이용하여 형별 검사를 하는 방법으로 SSO (sequence specific oligonucleotide), reverse SSO hybridization, RFLP (restriction fragment length polymorphism), SSP (sequence specific primer), SSCP (sequence specific conformational polymorphism), RSCA (reference strand-mediated conformational analysis)등의 방법이 있으며, direct sequencing에 의한 방법도 있다. 최근에는 DNA chip을 이용한 검사방법이 개발되고 있으며 국내에서도 많은 연구가 이루어져 있으며 조혈모세포은행에서는 다량의 sample을 동시에 검사할 수 있는 DNA chip개발과 high resolution 까지 검사 할 수 있는 APEX (arrayed primer extension) DNA chip을 개발하여 사용하고 있다.

가톨릭조혈모세포은행에서 사용하고 있는 HLA DNA 검사법

ARMs-PCR 법 HLA-A, B, C, DRB1, DQB1, DPB1 유전자형을 검사하기 위해 개발하여 사용하고 있으며 현재 가톨릭 조혈모세포은행에서 저해상도(low resolution) 검사 시 주로 사용되고 있다. ARMS (amplification refractory mutation system)의 원리는 primer의 3' 말단에서 하나의 염기가 틀리면 증폭시키고자하는 유전자의 부위가 적절한 조건하에서 증폭되지 않는다는 원리를 이용하여 다양한 부위를 증폭할 수 있도록 primer들을 고안하고 DNA 증폭여부를 확인하기 위해 이들 primer외에 positive internal control primer 4개를 사용하여 중합효소 반응을 시켜 증폭된 DNA를 agarose gels에서 전기영동 시킨 후 PCR의 증폭유무에 의해 형별을 판별하는 방법.

PCR-SSOP 법 HLA-A, B, C, DRB1, DQB1유전자형을 검사하기 위해 개발한 방법으로 다량의 검사시 사용되고 있는 방법 low resolution 검사 시 주로 사용되고 있다. PCR-SSOP(sequence specific oligonucleotide probe)방법은 다양성이 있는 유전자 부위를 PCR을 이용하여 증폭 시키고 변성시켜 membrane에 고정하고 각 대립유전자에 특이한 allele specific oligonucleotide probe와 교잡반응을 실시하여 그 반응양상에 따라 HLA 유전자 형을 판별하는 방법.

PCR-SBT법 HLA-A, B, C, DRB1, DQB1, DPB1 유전자형을 고해상도 (high resolution)로 검사 하고자 할 때 사용되는 방법으로 가톨릭조혈모세포은행에서는 주로 환자와 공여자 최종확인 검사 시 사용되고 있는 방법이다. PCR-SBT (sequence based typing)방법은 염기서열 분석(sequencing)방법에 의해 이루어지는 방법으로 현재 HLA 검사 시 가장 정밀한 검사법으로 알려져 있다.

High throughput HLA typing chip 방법 가톨릭조혈모세포은행은 최근 다량의 sample을 한꺼번에 검사할 수 있는 High throughput HLA typing chip방법을 이용하여 HLA-A, B 검사법을 개발사용하고 있다. High throughput HLA typing chip의 원리는 다양성이 있는 유전자 부위를 PCR을 이용하여 증폭 glass에 부착시킨 후 각 대립유전자에 특이한 allele specific oligonucleotide probe와 교잡반응을 실시하여 그 반응양상에 따라 HLA 유전자형을 판별하는 방법으로 이와 같은 방법을 이용하면 1,000여명을 동시에 검사 할 수 있으며 현재 조혈모세포은행에서는 조혈모세포 기증희망자 검사 시 일부 사용되고 있다.

APEX DNA chip법 HLA 검사를 DNA chip을 이용하여 고해상도 (high resolution) 수준까지 검사 할 수 있는 방법으로 최근 가톨릭조혈모세포은행은 HLA-A, HLA-DRB1 유전자를 검사 할 수 있는 방법을 개발 하였다. APEX (arrayed primer extension)DNA chip의 원리는 HLA 유전자의 다양성이 있는 부위를 증폭시킨 후 각 대립유전자에 특이한 prmer들이 부착된 glass에서 한 염기를 중합효소반응 시켜 그 반응양상에 따라 HLA 유전자형을 판별하는 방법이다.

면역 유전자 검사법

사이토카인 유전자 검사법 개발 가톨릭 조혈모세포은행에서는 조혈모세포이식의 성공률과 연관성이 있는 것으로 알려진 사이토카인 유전자의 다양성을 동시에 검사할 수 있는 방법을 PCR-SSP방법을 이용하여 개발하였다. 검사 할 수 있는 사이토카인 유전자는 15 종류 유전자(IL-1α, IL-1β, IL-1R,?IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-4Rα, IL-10, IL-12, γIFN, TNFα, TGFβ, IL-18, Fas, TNFβ)이며 이들 유전자에서 25 SNP (single nucleotide polymorphism)을 검사 할 수 있다.

KIR (killer cell inhibitor receptor) 최근 가톨릭 조혈모세포은행에서 조혈모세포이식의 성공률과 연관성이 있는 것으로 알려진KIR 유전자를 검사 할 수 있는 ARMs-PCR방법을 개발하였다. 검사 할 수 있는 KIR유전자는 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR2DS6, KIR3DS1 15종류를 분석할 수 있다.